1 色譜柱的類(lèi)型
　　常用的色譜柱填充劑有硅膠和化學(xué)鍵合硅膠、離子交換樹(shù)脂、凝膠或玻璃微球等填充劑。在化學(xué)鍵合硅膠中以十六烷基硅烷鍵合硅膠zui常用,辛基硅烷鍵合硅膠次之,氰基或氨基鍵合硅膠也有使用。近年來(lái),由于蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)分離提純技術(shù)的飛速發(fā)展,離子交換色譜柱、凝膠色譜柱的應(yīng)用也越來(lái)越廣。

　　2 影響色譜柱使用壽命的因素
　　2.1 流動(dòng)相
　　在以水溶液為流動(dòng)相時(shí),水溶液中的微生物例如細(xì)菌容易生長(zhǎng),當(dāng)用水溶液或有機(jī)酸緩沖液保護(hù)柱子時(shí),一些霉菌可能在色譜柱中滋生,堵塞固定相顆粒間的空隙。由于濕法填充技術(shù)的問(wèn)世,目前普遍使用的色譜柱填料直徑一般都小于10um,流動(dòng)相中的顆粒雜質(zhì)很容易先沉積在柱頭然后慢慢堵塞柱子。流動(dòng)相的pH值對(duì)色譜柱也有影響,特別是對(duì)化學(xué)鍵合硅膠填料,水溶液的pHzui適范圍在2~7.5之間,當(dāng)pH>8時(shí),硅膠會(huì)釋出生成絮狀物堵塞柱子,且難以復(fù)原,柱效很快降低,甚至*失效。當(dāng)在緩沖液中加入有機(jī)溶劑例如甲醇或乙腈時(shí),鹽類(lèi)的溶解度下降,會(huì)析出鹽沉淀,堵塞柱子。同時(shí)流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑和鹽會(huì)腐蝕色譜柱頭的篩板,產(chǎn)生柱頭凹陷。流動(dòng)相的極性對(duì)柱子也有一定影響,對(duì)于硅膠柱,甲醇、水、冰乙酸等極性較大物質(zhì)會(huì)破壞填料,反之,對(duì)于化學(xué)鍵合硅膠,極性小的物質(zhì)如正丁醇、二氯甲烷等也起同樣的作用。堿性溶液會(huì)破壞陽(yáng)離子交換樹(shù)脂色譜柱,而酸性溶液容易損壞陰離子交換樹(shù)脂柱。

　　2.2 樣品和固定相
　　如果有少量或微量的樣品不能夠溶解在流動(dòng)相中,在通過(guò)固定相會(huì)堵塞柱子。樣品中的顆粒雜質(zhì)也會(huì)堵塞柱子。樣品組分例如糖、蛋白質(zhì)等通過(guò)柱子時(shí)會(huì)產(chǎn)生不可逆吸附,這樣固定相的活性點(diǎn)被覆蓋。樣品組分還會(huì)與固定相產(chǎn)生反應(yīng),尤其是對(duì)于氨基柱的影響較為嚴(yán)重,因?yàn)榘被着c酐、酮形成希夫（Schiff）縮合而減少活性點(diǎn),使保留時(shí)間縮短。色譜柱鍵合相基團(tuán)脫落、固定相分解和活性基團(tuán)變性以及會(huì)影響柱效和保留時(shí)間的顯著改變。大多數(shù)鍵合相都是通過(guò)硅氧硅鍵（Si-O-Si）連接在硅基質(zhì)上,形成帶有有機(jī)基團(tuán)的固定相Si-O-Si-R（R為CnH2n+1）,硅氧硅鍵可能在水溶液中水解而斷裂,使鍵合基團(tuán)脫落。

　　3    HPLC色譜柱的管理
　　3.1 色譜柱的管理
　　制定色譜柱管理的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程并嚴(yán)格執(zhí)行。每一根新購(gòu)進(jìn)的色譜柱必須造冊(cè)登記,內(nèi)容包括:生產(chǎn)公司、品名、型號(hào)、規(guī)格、購(gòu)進(jìn)時(shí)間、啟用時(shí)間、單價(jià)、柱內(nèi)保護(hù)溶液等。色譜柱分類(lèi)存放,硅膠柱、化學(xué)鍵合硅膠柱、氰基或氨基柱、離子交換樹(shù)脂柱、凝膠柱各用一個(gè)色譜柱盒,盒上貼上標(biāo)簽,注明類(lèi)別。隨柱說(shuō)明書(shū)裝入密實(shí)袋附在登記本上。每啟用一根色譜柱,在色譜柱上貼上標(biāo)簽,注明啟用日期。每根柱子每?jī)蓚€(gè)月保養(yǎng)一次,特別是對(duì)于一些使用頻率少的柱子,因?yàn)榉胖脮r(shí)間長(zhǎng),容易干柱,每一次做好保養(yǎng)記錄。對(duì)于確已失效的柱子,做好停用記錄,不能隨意丟棄,專(zhuān)門(mén)存放,如果現(xiàn)用的柱子的填料需要填補(bǔ),可以用存放的柱子的填料。在從事生產(chǎn)的單位的質(zhì)檢部門(mén),對(duì)于使用時(shí)間較長(zhǎng)柱效降低的柱子,可把它用于檢測(cè)產(chǎn)品的中間體。

　　3.2 色譜柱的保養(yǎng)
　　色譜柱使用一段時(shí)間后,常遇到柱子被污染,柱效會(huì)有一定程度的下降,采用適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)色譜柱進(jìn)行保護(hù),可以延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命。
　　樣品和流動(dòng)相的處理:溶解的樣品進(jìn)樣前用濾膜過(guò)濾,以除去不溶物。如果必要,需進(jìn)行樣品的預(yù)處理。流動(dòng)相中如有不純物質(zhì)將影響柱效,所以溶劑盡量使用色譜級(jí)別的,至少是分析純級(jí)別,流動(dòng)相使用前用微孔薄膜過(guò)濾。在流動(dòng)相的輸液管前安裝過(guò)濾器。過(guò)濾器定期用甲醇超聲清洗,如果效果不好,可用10%的稀硝酸浸泡清洗。對(duì)于堵塞嚴(yán)重的過(guò)濾器,可在火焰上灼燒后再清洗。
　　保護(hù)柱（預(yù)柱）的使用:對(duì)于較昂貴的色譜柱,可以在柱前加一保護(hù)柱,防止樣品中雜質(zhì)污染分析柱,對(duì)于制備柱,因其進(jìn)樣量大,使用保護(hù)柱尤為重要。
　　常規(guī)處理:硅膠、氧化鋁、極性鍵合相色譜柱每一次用完后用低流速長(zhǎng)時(shí)間的二氯甲烷或正己烷等溶劑沖洗;鍵合相硅膠色譜柱、離子交換色譜柱和凝膠色譜柱先用蒸餾水沖洗,再用甲醇沖洗,然后用甲醇與蒸餾水以一定比例混合的溶液沖洗后過(guò)夜。
　　對(duì)于已使用一段時(shí)間后柱效下降的色譜柱可按以下方法進(jìn)行再生。再生處理包括活化（右→左）和凈化（左→右）兩種。硅膠、氧化鋁、極性鍵合相色譜柱按下列順序沖洗:*基戊烷或己烷←→三氯乙烷←→乙酸乙脂←→丙酮←→乙醇←→水。鍵合相硅膠柱:蒸餾水←→甲醇（沖洗過(guò)程中可加入少量二甲基甲酰胺）。離子交換樹(shù)脂柱:高濃度的NaCl溶液（1-2molL的NaCl溶液）可使大部分樹(shù)脂再生,油脂等少數(shù)與樹(shù)脂緊密結(jié)合的物質(zhì)可用低濃度堿溶液（如0.1molL的NaOH溶液）沖洗,酸性有機(jī)物吸附在固定相的用低pH緩沖液沖洗,堿性有機(jī)物用高pH緩沖液沖洗,然后再用蒸餾水←→甲醇←→二氯甲烷←→甲醇←→蒸餾水沖洗。凝膠色譜柱:由于凝膠色譜柱是根據(jù)被分離物質(zhì)的分子量大小而分離物質(zhì),通常用稀的氫氧化鈉或非離子型去垢劑（0.2%-1%NP-40或Lubrol）沖洗可除去大部分的結(jié)合物質(zhì),如果一些污染物仍然不能清除時(shí),用24%或30%乙腈沖洗過(guò)夜可除去疏水蛋白,用30%-50%乙酸可除去親水蛋白,用蛋白水解酶處理可分解凝膠中剩余的痕量胃蛋白酶,然后再用蒸餾水←→甲醇←→蒸餾水沖洗。
　　已污染的色譜柱的處理:因保留強(qiáng)的物質(zhì)污染,流動(dòng)相或樣品中不溶物沉積于柱頭,可用下列方法洗滌:去除脂類(lèi)可用四氫呋喃、乙腈或甲醇洗滌;去除蛋白質(zhì)可用乙腈、丙醇和1%三氯乙酸進(jìn)行梯度洗脫;一些高疏水性化合物可用乙腈或甲醇洗脫,同時(shí)反復(fù)注入100-200ml的四氫呋喃。
　　柱頭處理:對(duì)于柱頭堵塞污染嚴(yán)重的情況而且用溶劑沖洗無(wú)效的色譜柱,只有打開(kāi)柱子去除柱頂?shù)奶盍现匮b:先拆下不銹鋼燒結(jié)過(guò)濾器,檢查柱床,常見(jiàn)凹陷或受污染的帶色填料,剔去不規(guī)則床層和帶色填料,使柱床顯白色并*水平,再用甲醇作糊狀填料勻漿液,將糊狀填料勻漿液滴在柱上靠重力從勻漿液中排出甲醇液,重復(fù)直到填料水平。